1、将标准品和样品对应的微孔编号，每个标准品和样品做双孔平行，并记录标准品和样品的位置。

    2、在标准品孔中加入50l各标准品溶液，酶标仪在各样品孔中加入50l样品溶液。

    3、在所有孔中加入50l的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光反应30分钟。

    4、小心揭开盖板膜，甩干孔中液体，用稀释好的洗涤液（250μl/孔）充分洗涤微孔板3次，在吸水纸上拍干（拍干后未清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

    5、酶标仪在所有孔中加入100l的酶标二抗，酶标仪用盖板膜封板，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光反应30分钟。取出酶标板，按步骤4洗板5次。

    6、洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50l底物液A，再加50l底物液B，轻微晃动反应板使之彻底混匀，25℃环境避光显色15分钟(在颜色浅的情况下可适当延长反应时间，但总显色时间不要超过30分钟)。

    7、每孔中加入50l终止液，轻轻晃动使之彻底混匀，在450nm（建议使用双波长450/630nm）下检测吸光度，结果在5分钟内读取。